Pantoea agglomerans, что это?

Энтеробактерии: виды, характеристика, симптоматика, диагностика, как лечить

Энтеробактерии — большая группа микроорганизмов, обитающих в различных отделах ЖКТ и оказывающих позитивное или патогенное воздействие на организм человека. Все энтеробактерии подразделяются на три группы: патогенные, условно-патогенные и сапрофитные.

  • Большинство энтеробактерий являются представителями микробного биоценоза кишечника. Это клебсиелла, энтеробактер, серрация, протей, цитробактер, провиденция и иерсиния. Они выполняют в макроорганизме жизненно важные функции, но под воздействием негативных факторов становятся опасными и вызывают различные заболевания.
  • К абсолютным патогенам относятся шигеллы, сальмонеллы и некоторые виды эшерихий. Эти микробы, попав в организм человека извне, вызывают острые кишечные инфекции и прочие патологии, угрожающие жизни больного.
  • Сапрофитные энтеробактерии не опасны в эпидемиологическом отношении и не имеют значения для практической медицины.

возбудители кишечных инфекций

В семейство Enterobacteriaceae входит множество родов и видов, способных вызвать развитие серьезных заболеваний у человека. Одним из основных представителей данного семейства является энтеробактер. Он считается нормальным обитателем кишечника человека, обеспечивающим его адекватное функционирование. Проникая в другие органы, этот микроб становится причиной серьезных недугов. Чаще всего поражаются почки, мочевыводящие пути, органы репродуктивной и дыхательной систем. Enterobacter spp – одна из ведущих причин смерти новорожденных детей.

Этиология

Энтеробактерии — аспорогенные палочковидные бактерии, способные развиваться и размножаться как в присутствии кислорода, так и без него. Микробы имеют жгутики, обеспечивающие их подвижность, а некоторые образуют капсулу. По Граму они окрашиваются в красный цвет. Большинство бактерий ферментируют углеводы до кислоты и газа, являются оксидазоотрицательными и каталазоположительными, а также способными к денитрификации.

Энтеробактерии получают энергию из химических соединений. В качестве источника углерода они используют органические вещества. Бактерии растут на универсальных питательных средах, обязательным компонентом которых является лактоза. Они формируют характерные колонии: на Эндо – красные блестящие слизистые или мелкие бледно-розовые без отпечатка на среде, на Плоскирева – кирпично-красные, цвета среды или желтоватые колонии. При выращивании в бульоне Хоттингера бактерия вызывает равномерное помутнение с выпадением осадка. Температурный оптимум для них — 35-36 градусов.

Факторы патогенности бактерий:

  1. Ферменты,
  2. Эндотоксин,
  3. Белки-адгезины,
  4. Энтеротоксин,Ммикроворсинки.

Энтеробактерии отличаются высокой выживаемостью. Они устойчивы к большинству антисептиков, дезинфектантов и противомикробных средств.

Эпидемиологическое значение

Потенциально-патогенные энтеробактерии — постоянные «жители» человеческого организма, обитающие на эпителии кишечника в строго определенном количестве, которое не должно превышать 104 КОЕ/г. Под воздействием эндогенных или экзогенных факторов микробы начинают активно размножаться, утрачивают свои полезные качества и приобретают болезнетворные свойства. В организме формируется кишечный дисбиоз. При этом оппортунистические микробы начинают покидать пределы кишечника и, попадая в другие биоценозы, вызывать развитие различных недугов. Нередко инфекционная патология затрагивает органы мочевыделения, гепатобилиарной зоны, нервной системы. Со временем появляется доминирующий вид бактерий, который угнетает рост других. Он и становится непосредственной причиной патологии.

Патогенные бактерии — обитатели объектов внешней среды: водоемов, почвы, флоры и фауны. Широкое распространение микробов в природе не позволяет человеку полностью обезопасить себя.

Enterobacter cloacae при нормальных условиях не приносят вреда человеку. Они мирно сосуществуют с макроорганизмом без ущерба для здоровья. Бактерии обычно поражают больных в лечебных учреждениях, получающих длительную антибиотикотерапию. Они не опасны для здорового организма. Вместе с клебсиеллой, цитробактером, протеем и стафилококком энтеробактеры заселяют пищеварительный тракт. Большинство микробов из рода Enterobacter непатогенны для человека. Бактерии приобретают болезнетворные свойства при резком снижении иммунной защиты.

Резервуаром инфекции является больной человек или животное, в организме которого персистирует микроб. Вместе с калом больных энтеробактер попадает в окружающую среду. При этом фекалии становятся источником заражения. Входными воротами инфекции является ЖКТ. Распространение энтеробактерий происходит фекально-оральным или контактно-бытовым механизмами, которые реализуются алиментарным, водным, контактным, артифициальным и даже половым путями.

Патогенез

Заболевания, обусловленные энтеробактериями, чаще всего развиваются у лиц с иммунодефицитом.

Группу риска по энтеробактериальной инфекции составляют:

  1. Новорожденные,
  2. Пожилые люди,
  3. Часто болеющие лица,
  4. Больные хроническими патологиями ЖКТ,
  5. Пациенты, длительно находящиеся на стационарном лечении.

Кишечные микробы вызывают не только заболевания органов пищеварения, но и близлежащих структур. Воспаление может развиться практически в любой части тела человека: от зева до ануса.

Патологии, которые вызывают энтеробактерии:

  • Дисбактериоз, дизентерия, сальмонеллез, эшерихиоз.
  • Воспаление мочевыводящих путей и органов.
  • Пневмония.
  • Менингит, абсцедирование мозговой ткани и прочие ликворные нарушения.
  • Инфекция органов женской репродуктивной системы.
  • Воспаление органов гепатобилиарной зоны.
  • Гематогенные расстройства — бактериемия, сепсис.

Энтеробактерии являются возбудителями внутрибольничных инфекций. Микробы проникают в кровяное русло при проведении инвазивных манипуляций, катетеризации мочевого пузыря или внутривенного введения нестерильных лекарств. В обширных очагах довольно сложно снизить активность бактерий.

В результате взаимодействия возбудителя и соответствующих структур макроорганизма развивается инфекционный процесс, который состоит из адгезии, инвазии, колонизации, токсинообразования.

Энтеробактер обладает тропизмом к эпителиоцитам кишечника. Адгезия осуществляется за счет приближения микроба, а также взаимодействия его ворсинок с рецепторами эпителия. Бактерии проникают внутрь клетки и начинают активно размножаться. Процессы колонизации и токсинообразования определяют выраженность и разнообразие клинических проявлений инфекции.

Симптоматика

Энтеробактериозы обычно протекают без каких-либо особенностей в симптоматике. Клинические признаки заболеваний определяются локализацией очага поражения и видом возбудителя.

Общие проявления патологии:

  1. Боль в очаге поражения различной интенсивности, длительности, распространенности.
  2. Общее недомогание, слабость, вялость, разбитость, снижение работоспособности.
  3. Признаки воспаления на гемограмме – лейкоцитоз и подъем СОЭ.
  4. Лихорадка, озноб, миалгия, артралгия, бледность кожи, снижение аппетита, нарушение сознания.
  5. Диспепсия — тошнота, рвота, изжога, метеоризм.
  6. Нарушение стула — изменение консистенции, появление патологических примесей.

Enterobacter aerogenes является возбудителем менингита, который нередко осложняется абсцедированием вещества мозга. У больных возникает интоксикация, очаговые неврологические симптомы, менингеальные знаки. При поражении мочевыводящих путей у больных появляется дизурия, боль в конце акта мочеиспускания. Воспаление желчного пузыря и протоков проявляется болью и спазмами в правом подреберье. Воспалительный процесс в легочной ткани развивается у каждого четвертого носителя. У больных на фоне выраженной интоксикации возникает кашель с гнойной мокротой. При отсутствии соответствующей терапии формируются тяжелые осложнения – коллапс и шок.

Диагностика

Диагностика энтеробактериальной инфекции заключается в проведении лабораторных исследований. Специалисты выслушивают жалобы больных, собирают анамнез жизни и болезни, проводят общий осмотр.

Лабораторная диагностика:

  • В гемограмме — лейкоцитоз, сдвиг формулы влево, подъем СОЭ.
  • Бакпосев мочи проводится с целью выделения возбудителя патологии органов мочевыделения. Бактериурия — содержание в 1 мл мочи более 105 микробных тел энтеробактерий. Когда этот признак сочетается с выраженной и характерной симптоматикой, требуется незамедлительное лечение в стационаре.
  • Исследование кала проводят с целью определения причины кишечной дисфункции. Для выявления патогенных бактерий у больных берут мазок из прямой кишки и делают посев на среды, содержащие специальные красители и углеводы. Для этого используют простые пластинчатые среды Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитный агар, а также среды накопления — селенитовый бульон или магниевую среду. После суточной инкубации изучают характер роста и проводят дальнейшую идентификацию путем изучения биохимических свойств на средах цветного ряда. В окрашенных по Граму мазках обнаруживают красные короткие палочки, образующие цепочки или располагающиеся хаотично. Enterobacter cloacae на твердых питательных средах образует слизистые лактозонегативные колонии. Подтверждают предполагаемый диагноз с помощью реакции агглютинации на стекле. После обнаружения возбудителя патологии проводят тест на чувствительность к антибиотикам и фагам.
  • Микробиологический анализ кала на условно-патогенные энтеробактерии проводится количественным методом. Для этого нативный кал пациента суспендируют в физрастворе и готовят ряд его десятикратных разведений. Затем производят высев из каждого разведения на селективные среды. Для энтеробактера используют чашечную среду Симмонса. После инкубации изучают рост культуры, подсчитывают количество характерных колоний и готовят препарат для микроскопии. Расчет производят по специальным формулам. В норме общее число энтеробактерий не должно превышать 104 КОЕ в 1 грамме фекалий. Увеличение этого количества является признаком кишечного дисбиоза.
  • Постановку диагноза при пневмонии, вызванной энтеробактериями, облегчает микробиологическое исследование мокроты на микрофлору.
  • При бактериемии выделяют возбудителя по гемокультуре или проводят анализ крови на стерильность.
  • Энтеробактерии в мазке у женщин можно обнаружить во время микробиологического исследования отделяемого влагалища или цервикального канала на микрофлору. Если наблюдается сплошной рост на чашках или количество характерных колоний превышает 100, делают вывод об этиологической роли энтеробактерий.
  • Вспомогательные методы – УЗИ желчного пузыря, поджелудочной железы, почек и эндоскопическое исследование желудка и кишечника.

Методы лечения

Лечение энтеробактериальной инфекции этиотропное, антибактериальное. Его назначают после определения локализации поражения. На начальных стадиях заболевания, когда этиология не выяснена, проводят эмпирическую терапию. Врачи назначают лекарства на основе видимых симптомов, руководствуясь собственным опытом. При доброкачественном течении заболевания подобное лечение позволяет устранить все симптомы в течение 6-12 дней. Во всех остальных случаях показано лечение антибиотиками. Больные из группы риска лечатся исключительно антибактериальными препаратами после полной идентификации патогенного организма.

Обычно применяют антибиотики широкого спектра из группы пенициллинов «Амоксиклав», «Аугментин», цефалоспоринов «Цефтриаксон», «Цефазолин», аминогликозидов «Кларитромицин», «Азитромицин», фторхинолонов «Ципрофлоксацин», «Офлоксацин». У разных штаммов бактерий чувствительность к этим препаратам может существенно отличаться. Специалисты часто комбинируют антибактериальные средства и назначают препараты, усиливающие действие антибиотиков и стимулирующие иммунную систему организма.

Дополнительно назначают пре- и пробиотики – «Линекс», «Хилак форте», «Бифиформ», а также иммуномодуляторы «Исмиген», «Полиоксидоний».

Симптоматическая терапия проводится по принципам лечения острых кишечных инфекций. Больным назначают спазмолитики «Но-шпу», «Спазмалгон», обволакивающие средства «Смекту», противорвотные препараты «Мотилиум», «Церукал», энтеросорбенты «Полисорб», «Пипольфен», ферменты — «Креон-Д», «Мезим», «Панзинорм», лекарства от вздутия – «Эспумизан», «Редугаз», витаминные комплексы.

Чтобы лечение было максимально эффективным и дало результаты в кратчайшие сроки, необходимо соблюдать щадящую диету. Диетотерапия заключается в исключении из рациона алкоголя, жирных, жареных, острых, соленных, пряных блюд, кондитерских изделий, хлебобулочной продукции, овощей и фруктов, содержащих много клетчатки и усиливающих процессы газообразования в кишечнике. Рекомендованы кисломолочные продукты, легкоусвояемые блюда и перетертые пюре, не раздражающие слизистую ЖКТ. Готовить следует на пару. Больным показано дробное питание небольшими порциями через каждые 2-3 часа. Строгий рацион — необходимое условия в период лечения и восстановления. Соблюдение принципов правильного лечебного питания позволит организму реабилитироваться после болезни за 2-3 дня.

Рвота и понос — причина потери организмом жидкости и минеральных веществ. Чтобы быстрее избавиться от токсинов, необходимо больным обеспечить правильный питьевой режим. При этом пить желательно не просто воду, а растворы, восстанавливающие минеральный баланс.

Своевременное и адекватное лечение делает прогноз заболевания благоприятным. Проблемы со стулом и общим самочувствием могут длительно сохраняться у пожилых людей, маленьких детей и лиц с ослабленным иммунитетом.

Профилактические мероприятия

Профилактические мероприятия, предупреждающие развитие заболеваний, вызванных энтеробактериями:

  1. Укрепление иммунитета,
  2. Соблюдение гигиенических норм и правил,
  3. Употребление в пищу качественных продуктов питания, чистых овощей и фруктов, термически обработанных мясных изделий,
  4. Исключение контактов с больными ОКИ,
  5. Проведение в домашних условиях влажной уборки с периодическим мытьем индивидуальных бытовых предметов,
  6. Содержание в чистоте жилища и прилегающей территории,
  7. Поддержание иммунитета на оптимальном уровне — закаливание, правильное питание, физическая активность, отсутствие стрессов, борьба с вредными привычками.

При появлении признаков кишечного расстройства и дискомфорта в животе показан профилактический прием пре- и пробиотиков, витаминов и минеральных веществ.

Опасность бактерий рода Энтеробактер для человека

Энтеробактеры представляют собой грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, покрытых жгутиками. Они не образуют спор, развиваются в анаэробных условиях, но способны выживать в присутствии кислорода. Большинство данных микроорганизмов входят в состав нормальной кишечной микрофлоры человека и животных, а некоторые обитают в воде, почве и продуктах питания.

Энтеробактер под микроскопом выглядит как палочка со жгутиками

Типичные представители энтеробактерий

Бактерии рода Enterobacter относятся к семейству enterobacteriaceae и включают в себя 12 видов, относящихся преимущественно к условно патогенной флоре, населяющей кишечник человека. Наибольший интерес для медиков имеют энтеробактеры, которые при определенных условиях способны вызывать заболевания у людей.

  1. Enterobacter cloacae является представителем нормальной микрофлоры дистального отдела кишечника. Но после приема антибиотиков, при снижении иммунитета или развитии дисбактериоза, его усиленное размножение приводит к нарушению работы ЖКТ. Из-за непосредственной близости ануса к наружным половым органам у женщин может происходить инфицирование, приводящее к вагинитам, цервицитам и воспалениям других отделов мочеполовой системы. Развитие микроорганизмов в дыхательных путях приводит к тяжелой форме пневмонии, а вот проникновение их в кровяное русло вызывает септицемию.
  2. Enterobacter aerogenes чаще других микробов является причиной больничных инфекций. Особую опасность представляет инфицирование внутрисосудистых катетеров, шунтов и протезов, провоцирующее инфекционный эндокардит, тромбофлебит или общий сепсис.
  3. Enterobacter agglomerans, обозначенные в современной литературе термином Pantoea agglomerans, поражают преимущественно органы мочеполовой системы мужчин и женщин, а также респираторный тракт.
  4. Enterobacter sakazakii, отнесенный в последнее время к роду Cronobacter, представляет большую опасность для новорожденных детей, особенно, имеющих недостаточную массу тела, аномалии развития и врожденные заболевания иммунной системы. Доказано, что Энтеробактер саказаки вызывает инфекционное воспаление оболочек головного и спинного мозга, образование некротических очагов на стенках кишечника, явления сепсиса.
  5. Enterobacter gergoviae, переименованный в Pluralibacter gergoviae, вызывает кишечные расстройства, поражения органов выделения, дыхания и размножения.

Другие условно патогенные бактерии рода энтеробактер, к которым относятся Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter ludwigii и Enterobacter kobei поражают преимущественно ЖКТ и респираторные органы.

Обнаружить микроб можно в разных средах человеческого организма

Иногда в результатах анализов встречается термин «лактозонегативные энтеробактерии», что указывает на наличие микроорганизмов, препятствующих правильному перевариванию продуктов и вызывающих изжогу, метеоризм, диарею, срыгивание и другие диспептические явления. В составе нормальной микрофлоры их количество не должно превышать 5%.

Таксономическая принадлежность

Род: Enterobacter

Семейство: Enterobacteriaceae

Группа: V грамотрицательные факультативные анаэробы

Отдел: I грамотрицательные микроорганизмы

Царство: Prokaryote

Название рода было утверждено в 1963 году. Но проведенные в последующем исследования генома привели к существенным изменениям в систематике. В результате этого E.agglomerans выделили в отдельный род Pantoea, а E.sakazakii отнесли к роду Cronobacter.

Поэтому современная классификация включает 12 видов бактерий рода энтеробактер, из которых наибольшее эпидемиологическое значение имеют энтеробактер клоака и аэрогенес.

Строение, жизненный цикл и свойства микробов

По внешнему строению энтеробактеры напоминают прямые палочки. Их тело полностью покрыто жгутиками, обеспечивающими движение. Единственным неподвижным видом является E.asburiae.

Выращивание в лабораторных условиях позволяет выявить Enterobacter в анализах

Диаметр микроорганизмов колеблется от 0,6 до 1 мкм, а длина — от 1.2 до 3 мкм. При диагностическом исследовании в мазках обнаруживаются единичные или соединенные в короткие цепочки бактерии. Все представители кишечной группы рода энтеробактер быстро растут на стандартных и селективно-дифференциальных питательных средах.

Бактерии принадлежат к группе факультативных анаэробов, не образуют спор, но у некоторых штаммов имеются капсулы. Местом их обитания являются слизистые оболочки кишечного тракта, органов мочеполовой системы и дыхания. При этом микроорганизмы способны выживать в экскрементах, почве, водоемах, на растениях, кожных покровах животных и других объектах внешней среды.

Род энтеробактер становится заразен для людей в период снижения резистентности организма или после длительного курса антибиотикотерапии. В первую очередь ускоряется пролиферация Enterobacter cloacae в тонком кишечнике, что для данных бактерий не характерно, так как большинство их населяет толстый отдел.

Энтеробактеры опасны для новорожденных младенцев с ослабленным иммунитетом в период прохождения через родовые пути. Инфицирование человека может произойти при попадании большого количества микроорганизмов с недоброкачественными продуктами питания или при заглатывании воды в открытых водоемах.

Низкая чувствительность к антибиотикам у представителей энтеробактер приводит к тому, что они быстро замещают лакто- и бифидобактерии, количество которых резко снижается во время продолжительного применения человеком антибиотиков. Такой дисбактериоз приводит к возникновению заболеваний.

Лабораторная диагностика: что означают цифры

У взрослого человека в кишечнике содержание микроорганизмов рода энтеробактер, включающих в себя Enterobacter cloacae, aerogenes и другие виды, не должно превышать 104 колониеобразующих единиц на 1 г кала.

Бактерии энтеробактер в кале ребенка появляется с первых дней жизни, но его количество и соотношение с другими микроорганизмами будет постоянно изменяться, так как в первые 3-4 месяца идет интенсивное заселение кишечника. Искусственное введение в организм малыша бифидо и лактобактерий позволяет поддерживать баланс микрофлоры кишечника.

При выявлении у новорожденных детей пневмонии, возникает подозрение на инфицирование их во время прохождения родовых путей. В этом случае у матери в мазке из цервикального канала обнаруживается Enterobacter aerogenes с концентрацией более 105КОЕ. Чтобы предотвратить такой путь заражения беременным проводят бакпосев на обнаружение Enterobacter aerogenes, Cronobacter sakazakii и некоторых других микроорганизмов, выявляемых при обычном бакпосеве.

Инфицирование ребенка может произойти, если в грудном молоке матери высеян энтеробактер, концентрация которого превышает допустимые показатели. Однако диагноз подтверждается после возникновения характерных клинических признаков и обнаружении Enterobacter cloacae в кале у ребенка в количестве, превышающем 104КОЕ.

Анализ мочи проводится для выяснения причин возникновения урогенитальных инфекций и выявления скрытых воспалений почек и мочевого пузыря. Если при отсутствии клинических симптомов у женщин концентрация энтеробактер в 1 мл мочи превышает 105КОЕ, то диагноз подтверждается, и назначается курс лечения. Если же количество в моче Enterobacter cloacae ниже данного показателя, то это свидетельствует о загрязнении лабораторного материала во время его забора.

Если клиника заболевания имеет выраженный характер, то допустимый порог в 1 мл мочи составляет не более Enterobacter cloacae 10 в 4 степени.

Делая посев из зева, следует знать, какая норма энтеробактер аэрогенес должна быть у человека, так как ее превышение может спровоцировать тяжелую форму пневмонии. Если показатель превышает Enterobacter aerogenes 10 2КОЕ и сопровождается клиническими признаками, то следует начинать немедленное лечение.

Пациенты, у которых выявлено наличие энтеробактера клоаке в горле, но не имеющие симптомов поражения респираторного тракта, считаются носителями. У них значительно повышается риск возникновения пневмонии при попадании в условия стационара, так как на ее долю приходится 10% случаев от совокупности внутрибольничных инфекций.

Для определения рисков инфекции разработаны стандарты лабораторной диагностики

Норма энтеробактер клоаке в зеве составляет от 102 до 104КОЕ, но при этом их количество не должно значительно превышать концентрацию других форм нормальной микрофлоры.

В чем опасность для человека

Наибольшую опасность энтеробактеры представляют для новорожденных, так как вызывают:

  • менингит;
  • гнойное воспаление почек и мочевыводящих путей;
  • некротический колит;
  • тяжелые поражения кровеносной и лимфатической системы;
  • гнойничковые и язвенные поражения кожи у грудничков.

Летальность при этом составляет от 55 до 80%.

Респираторные заболевания, вызванные Enterobacter cloacae, которые локализуются в горле, проявляются повышением температуры тела, слабостью и продуктивным кашлем. Опасность данных инфекционных заболеваний заключается в том, что даже при грамотной своевременной терапии могут наблюдаться параличи, резкое падение кровяного давления, приводящее к потере сознания, асфиксия. Смертность составляет до 25%.

Энтеробактеры являются возбудителями бактеремий, при которых происходит интенсивное размножение микроорганизмов в крови, приводя к развитию патологий во всех внутренних органах.

У мужчин бактерии рода энтеробактер часто вызывают простатиты и уретриты. У женщин они становятся причиной воспалений органов мочеполовой системы, которые очень тяжело поддаются лечению.

Наиболее восприимчивыми являются люди, перенесшие серьезные травмы, больные сахарным диабетом, а также другими болезнями, подавляющими синтез клеток иммунитета.

Особенности лечения

Так как представители рода Enterobacter spp. устойчивы ко многим антимикробным препаратам, то перед началом лечения необходимо установить чувствительность выделенного микроорганизма к конкретному антибиотику. Далее назначается комплексная терапия, позволяющая, как избавиться от представителей энтеробактер и устранить симптомы вызванного ими заболевания, так и повысить общую резистентность организма.

С этой целью применяются аминогликозиды, Бета-лактамы, тетрациклины и цефалоспорины 3-го поколения. Наиболее широкое применение в борьбе с энтеробактер клоаке и аэрогенес нашел Метронидазол, Пиперациллин, Цефтриаксон, Ко-амоксиклав, Гентамицин.

Целесообразны комбинации антимикробных препаратов и средств, потенцирующих их действие. Но такое совмещение может назначаться только врачом после получения результатов лабораторных анализов.

Инновацией в лечении заболеваний, вызванных энтеробактерами, является применение бактериофага Энтеробактер поливалентного очищенного. Ранее ученым не удавалось создать бактериофаг, какой бы объединял несколько фагов рода энтеробактер, включающих в себя Э. клоака, Э. аэрогенес и Э. аггломеранс, отделенных от метаболитов бактерий.

Его эффективность доказана при следующих патологиях:

  • ЛОР-заболевания;
  • гастроэнтероколиты;
  • хирургические гнойные инфекции;
  • пневмонии;
  • дисбактериоз;
  • заболевания мочеполовой сферы у мужчин и женщин.

Данный препарат может применяться детям с первых дней жизни.

Другим проверенным средством против бактерий энтеробактер является бактериальный Секстафаг, воздействующий также на стафилококки, стрептококки, протеи, клебсиеллы и кишечную палочку.

Прежде, чем лечить заболевания, вызванные Enterobacter aerogenes у беременной женщины, следует знать о возможных патологиях, развивающихся у плода при приеме следующих лекарственных средств:

  • нитрофураны: гемолитическая анемия;
  • сульфаниламиды: желтуха и гемолитическая анемия;
  • аминогликозиды: отрицательное влияние на слух и работу почек;
  • нитроксолин: атрофия зрительного нерва.

Поэтому, выбирая, чем лечить инфекции, спровоцированные энтеробактер аэрогенес пациенткам в период вынашивания плода, медики отдают предпочтение пенициллинам и цефалоспоринам в сочетании с пробиотиками и щадящим рационом питания.

Лечение болезней, вызванных возбудителями энтеробактер, средствами народной медицины сводится к усилению иммунитета, восстановлению баланса микрофлоры кишечника, а также дезинфекции ротовой полости и влагалища у женщин. С этой целью применяются травяные сборы, в состав которых входит ромашка, зверобой, кора дуба, полынь, шалфей и некоторые другие травы.

Перед использованием любых народных методов необходимо проконсультироваться с врачом, так как самолечение может скрыть клинические симптомы заболевания, и инфекция перейдет в хроническую форму или вызовет осложнения.

1. Общие положения и область применения

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий
Enterobacter Sakazakii в продуктах
для питания детей раннего возраста

Методические указания
МУК 4.2.2428-08

Москва 2009

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 29 октября 2008 г.

4. Введены в действие с 15 декабря 2008 г.

5. Введены впервые

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

29 октября 2008 г.

Дата введения: 15 декабря 2008 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий Enterobacter Sakazakii
в продуктах для питания детей раннего возраста

Методические указания
МУК 4.2.2428-08

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий Enterobacter sakazakii — возбудителей пищевых токсикоинфекций у детей раннего возраста, при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1.3. Контролю на наличие бактерий Е. sakazakii подлежат детские молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни, при анализе которых на наличие патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, не были выявлены облигатные патогены, принадлежащие к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но выявлялся рост сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры.

1.4. Необходимость контроля указанных групп продукции на наличие Е. sakazakii обусловлена регистрацией в последние годы документированных спорадических случаев и вспышек септических инфекций и некротизирующего энтероколита у детей 1 года жизни, в первую очередь недоношенных, новорождённых с низкой массой тела или иммунокомпромиссных. Все случаи заболеваний связаны с употреблением детских молочных смесей, контаминированных Е. sakazakii, в т.ч. при очень низких уровнях возбудителя (1 — 10 КОЕ/г). При этом установлено, что в первую очередь Е. sakazakii может попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового продукта.

1.5. Предлагаемый метод определения бактерий Е. sakazakii в пищевых продуктах, предназначенных для детей раннего возраста, предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе. Настоящие методические указания также предусматривают определение количества Е. sakazakii в пищевых продуктах для детей раннего возраста методом наиболее вероятного числа (НВЧ).

1.6. Обнаружение Е. sakazakii в 300 г инстантных молочных смесей и продуктов прикорма сухих, предназначенных для детей 1 года жизни, или в 300 г сухих молочных смесей или специализированных продуктов для детей младше 6 месяцев, должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, свидетельствующее о высокой степени риска для детей данной возрастной категории, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания.

1.7. Методические указания носят рекомендательный характер.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

2. Сущность метода

2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие неселективные среды для предварительного обогащения проб, пересеве в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры.

Ниже представлена методическая схема определения Cronobacter spp.

Таблица 1

Схема исследования сухих детских смесей на наличие Cronobacter spp.

Этап

Продолжительность инкубации, ч

Температура

1. Подготовка реактивов и материалов

2. Растворение навесок продукта в забуференной пептонной воде (ЗПВ) в соотношении 1:9 (при необходимости определения количества — навесок массой 100, 10 и 1 г в 3 колбы или пробирки с ЗПВ каждая), смешивание и инкубация

18 ± 2

37 °С

3. Посев 0,1 см3 проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae и инкубация

24 ± 2

44 °С

4. Пересев 0,1 мл проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. (ESIA™) или фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar)

24 ± 2

44 °С

5. Отбор 5 подозрительных на Cronobacter spp. колоний с поверхности хромогенного ESIA-aгapa, отбор всех типов колоний с поверхности фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar); пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация

48 ± 2

25 °С

6. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности по биохимическим тестам идентификации

7. Интерпретация результатов.

При необходимости — подсчет наиболее вероятного числа (НВЧ) по количеству положительных проб в каждой из засеянных навесок продукта

2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к Е. sakazakii (Cronobacter spp.). Подтверждение принадлежности к Cronobacter spp. производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20Е, Rapid 20E, ID 32Е (ф. «БиоМерье», Франция) и др.

Определение биохимических характеристик, подтверждающих принадлежность выделенных штаммов к роду Cronobacter spp. и дифференцирующих их от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Биохимическая дифференциация Cronobacter spp.

Ведущими дифференцирующими признаками Cronobacter spp. являются:

• способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при температуре 25 °С;

• наличие α-глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид;

• отсутствие способности к ферментации D-сорбита.

Для дифференциации Cronobacter spp. от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Envinia spp.) используется тест разжижения желатины.».

(Новая редакция. Изм. от 26.11.2013)

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ±0,01

ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С

ТУ 64-1-28-70-76

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °С с отклонением от заданной ±1 °С

ТУ 64-1-1382-83

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °С с отклонением от заданной ±1 °С

ТУ 64-1-1382-83

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС

ГОСТ 8284-78

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

ГОСТ 19569-89Е

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с

ГОСТ 6709-72

Гомогенизатор перистальтического типа «Микс-2», «Стомайкер» или других наименований

AES Lab., Cat № AESAP1066

Гомогенизатор типа «вортекс»

Микропипетки на 200 — 1000 мкл

BIOHIT, Cat. № 720040 или «Ленпипет»

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

ТУ-16-535-84

Холодильник бытовой электрический

ГОСТ 16317-87

Пинцет медицинский

ГОСТ 21241-89

Ножницы медицинские

ГОСТ 21239-89

Скальпель хирургический, 15 см

ГОСТ 21240-89

Часы механические сигнальные

ГОСТ 3145-84

Электроплитка

ГОСТ 14919-83

Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания)

ТУ 64-1-2451-78

3.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости

ГОСТ 1770-74

Воронки стеклянные

ГОСТ 25336-82

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 5556-81

Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3

ГОСТ 29227-91

Пробирки типов П1, П2

ГОСТ 25336-82

Стекла предметные для микропрепаратов

ГОСТ 6672-75

Спиртовки лабораторные стеклянные

ГОСТ 23932-90

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С)

ГОСТ 13646-68

Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов

ГОСТ 23932-90

Пакеты стерильные для гомогенизатора

AESLab., Cat. № AES400/50G

Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности № 10

ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Денситометр для бактериальных суспензий типа «Densi-La-Meter» или «Денсимат»

ф. «Лахема», «BioMerieux»

Стандарт Макфарланда № 1, 2, 3

ф. «BioMerieux»

Петля бактериологическая

3.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-84

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

D-глюкоза, ч

ГОСТ 6038-79

D-лактоза, 1-водная

ТУ 6-09-22-98-79

Маннит

D-сорбит

Рамноза

Калия гидроокись

ГОСТ 24363-80

Калий фосфорно-кислый однозамещенный, ч

ГОСТ 4198-75

Калий фосфорно-кислый двузамещенный 3-водный

ГОСТ 2493-75

Кислота соляная, хч

ГОСТ 3118-77

Литий хлористый, ч или хч, или чда

ГОСТ 4328-77

Масло иммерсионное для микроскопии

ГОСТ 31739-78

Набор реактивов для окраски по Граму

Натрий-аммоний фосфорно-кислый двузамещенный, 4-водный, ч или хч

ГОСТ 4170-78

Натрия гидроокись, чда

ГОСТ 4328-77

Натрий лимонно-кислый, 5,5-водный, чда

ГОСТ 22280-75

Натрий хлористый, ч или хч, или чда

ГОСТ 4233-77

Пара-диметиламинобензальдегид, ч

ТУ 6-09-3272-77

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей

ГОСТ 13805-76

Спирт этиловый ректификованный технический

ГОСТ 18300-87

Спирт этиловый ректификованный

ГОСТ 5962-67

Феноловый красный

ГОСТ 5853-51

Фенолфталеин

ГОСТ 5850-72

Фуксин основной

ТУ 6-09-4119-75

Хлороформ технический

ГОСТ 2-15-76-72

Уксусная кислота

ГОСТ 61-75

Сульфаниловая кислота

α-Нафтол

Цинк порошкообразный

ГОСТ 3640

Желатин сухой

Экстракт дрожжевой сухой

Тест-штамм Enterobacter sakazakii, типичный по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам

ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Пептонная вода забуференная (сухая)

Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон

ФС 42-3377-97 (ГНЦПМ)

Питательный бульон и питательный агар

ТУ 10-02-02-789-176-94

Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)

HiMedia М1214

Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)

HiMedia М1263

Среды Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, рамнозой, дулыдатом, адонитом, сахарозой, сорбитом

ФС (ЦНИИВС им. И.И. Мечникова, НИИ питательных сред)

SIM-aгap (сероводород-индол-подвижность)

Среда Эндо

ТУ 9229-072-00419785

Агар желчный фиолетово-красный

ТУ 9229-072-00419785

Среда Кесслер с глюкозой

ГОСТ 30519-97

Бульон Мак-Конки с глюкозой

ГОСТ 30519-97

Бульон с желчью, бриллиантовым зеленым и глюкозой

ГОСТ 30519-97

Тест-системы биохимические для видовой идентификации API 20Е, Rapid 20Е, ID 32Е, для идентификации Enterobacteriaceae и других грамотрицательных палочек

Набор реактивов для окраски по Граму

Набор для постановки оксидазного теста

Модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон с ванкомицином (мЛСТ с ванкомицином)

Enterobacter sakazakii хромогенный агар (ESIA™) или селективные хромогенные среды аналогичного назначения, соответствующие требованиями стандарта ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

(Измененная редакция. Изм. от 26.11.2013)

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.1.1. Пептонно-солевой раствор

По ГОСТ 26669-85

4.1.2. Изотонический (0,85 %-й водный) раствор хлорида натрия

По ГОСТ 26669-85

4.1.3. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов по Граму

По ГОСТ 10444.1 или в соответствии с инструкцией по применению

4.1.4. Стерильный фосфатный буфер с pH 7,2 ± 0,1

KH2РO4 — 0,45 г, Na2HPО4 — 5,34 г в 1000 см3 дистиллированной Н2О, стерилизовать при температуре 121 °С в течение 30 мин

4.2. Приготовление питательных сред

4.2.1. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3, готовят согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

4.2.2. Питательный агар с 5 % глюкозы готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

4.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом.

Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 ± 0,2 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С.

4.2.4. Среда для определения подвижности: 20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, устанавливают pH 7,3 ± 0,2, разливают в пробирки по 5 — 7 см3 и стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин.

4.2.5. Среды Гисса с углеводами: 10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают pH 7,1 ± 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, «ВР» и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин.

4.2.6. Забуференная пептонная вода

Состав среды

Концентрация, г/дм3

Хлорид натрия (NaCl)

5,0

Ферментативный гидролизат казеина

10,0

Двузамещенный фосфат натрия 12-водный (Na2HPO4 × 12Н2O)

9,0

Однозамещенный фосфат калия (KН2РO4)

1,5

Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

4.2.7. Модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон (мЛСТ) с ванкомицином

Состав среды

Концентрация, г/дм3

Хлорид натрия (NaCl)

34,0

Пептон ферментативный

20,0

Лактоза

5,0

Однозамещенный фосфат калия (KH2РO4)

2,75

Двузамещенный фосфат калия (K2НРO4)

2,75

Лаурилсульфат натрия (C12H25NaO5S)

0,1

Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 6,8 ± 0,2 при 25 °С, разливают по 10 мл в пробирки и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Приготовление рабочего раствора ванкомицина: 10 мг ванкомицина растворяют в 10 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и стерилизуют методом мембранной фильтрации. Готовый раствор ванкомицина может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 15 суток.

Для получения готовой среды раствор ванкомицина вносят в каждую пробирку со стерильной основой мЛСТ в количестве 0,1 см3 для получения конечной концентрации ванкомицина в готовой среде 10 мкг/см3. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

4.2.8. Enterobacter sakazakii хромогенный агар (ESIA™)

Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Стерилизованную агаровую среду охлаждают до температуры 44 — 47 °С и разливают по 15 см3 в стерильные чашки Петри.

Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

5. Отбор и подготовка проб к анализу

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования на патогенные микроорганизмы и минимально вдвое превышать аналитический образец.

5.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров (или неупакованной) пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

5.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду.

5.4. Первичный посев исследуемых проб продуктов на патогенные микроорганизмы проводят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

5.5. При отсутствии роста облигатных патогенов, принадлежащих к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но при обнаружении роста сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры в нормируемых навесках исследуемых продуктов, от них отбирают дополнительные пробы (2 навески по 100 г при первичном посеве 100 г продукта, 2 невески по 125 г при первичном посеве 50 г, 2 навески по 137,5 г при первичном посеве 25 г) и анализируют в соответствии с процедурой, изложенной в разделе 6.

6. Проведение анализа

6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (см3).

Из подготовленной по п. 5 пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (см3) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 см3 ЗПВ и перемешивают.

Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (см3) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (см3) и производят посев в 90 см3 ЗПВ и перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (см3) и производят посев в 9 см3 ЗПВ. Для посева (при необходимости — предполагаемом высоком содержании Cronobacter spp. в продукте) меньших количеств продукта — 0,1 и 0,01 г, делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г, и вносят по 1 см3 (× 3) соответствующих разведений в 9 см3 ЗПВ.

Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (22 ± 2) ч.

6.3. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 0,1 см3 суспензии пересевают в 10 см3 модифицированного лаурилсульфат триптозного бульона с ванкомицином (арбитражная среда) или в 10 см3 одной из жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 29184-91 — среду Кесслер с глюкозой, или буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.4. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность хромогенного агара по п. 4.2.8 для выявления Cronobacter spp., содержащего 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид (арбитражная среда), или на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-aгap). Чашки с агаризованной средой предварительно подсушивают. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.5. При отсутствии роста на поверхности хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или VRBG-aгapa анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.6. После этапа селективного обогащения проб для обнаружения Cronobacter spp. (п. 6.3), допускается использовать ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2872-11. При получении отрицательных результатов исследований образцов предварительно обогащенных жидких селективных сред с применением ПЦР анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.7. При обнаружении на чашках хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. роста подозрительных культур для дальнейшего изучения отбирают 3 — 5 характерных колоний. При обнаружении на поверхности VRBG-aгapa роста дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты культур, для чего отбирают по 3 — 5 колоний каждого типа.

6.8. Отобранные для исследования 3 — 5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25 °С в течение (48 ± 2) ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм Е. sakazakii (Cronobacter spp.), типичный по фенотипическим свойствам.

6.9. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Cronobacter spp.».

(Новая редакция. Изм. от 26.11.2013)

7. Подтверждение принадлежности выделенных культур к Enterobacter sakazakii

7.1. Подтверждение принадлежности выделенных культур проводят с применением тест-систем для биохимической идентификации API 20Е, Rapid 20Е, ID 32Е.

7.2. К бактериям Enterobacter sakazakii относят культуры, имеющие характерные признаки роста на дифференциально-диагностических средах, при микроскопии по Граму окрашенные отрицательно, подвижные, оксидазоотрицательные, соответствующие комплексу признаков, указанных в табл. 2, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину. Бактерии Е. sakazakii обладают α-глюкозидазной активностью.

8. Учет результатов

8.1. Результаты оценивают по каждой исследованной пробе отдельно.

8.2. При получении положительного результата подтверждающего анализа дают заключение о выявлении Е. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

При получении отрицательного результата дают заключение об отсутствии Е. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

8.3. Учет результатов при количественном определении.

Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий Е. sakazakii при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому, используя таблицу, приведенную в приложении, находят наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий Е. sakazakii, соответствующее их содержанию в 1 г (см3) продукта.

Для окончательного определения НВЧ бактерий Е. sakazakii в анализируемом образце учитывают значение первой выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным наличием Е. sakazakii. Так, в случае если расчет ведется от посева массы (объема) 100 г (см3) (× 3) продукта, количество Е. sakazakii в 1 г (см3) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы соответственно установленному индексу, на 100. В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (× 3), количество Е. sakazakii в 1 г (см3) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ из таблицы на 10.

Пример: Бактерии Е. sakazakii обнаружены в трех повторностях при посеве 100 г, в трех повторностях при посеве 10 г и в одной — при посеве 1 г.

Результат по числу секторов с подтвержденным ростом бактерий Е. sakazakii из трех выбранных масс записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (см. приложение). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий Е. sakazakii составляет 0,46 КОЕ в 1 г продукта.

Если значение НВЧ по таблице составляет величину более чем 110 КОЕ (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении.

9. Требования безопасности

Исследования пищевых продуктов на наличие Enterobacter sakazakii проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

10.1. ГОСТ 30519-97 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae».

10.2. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

10.3. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований».

10.4. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10.5. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

10.6. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

10.7. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

10.8. СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

10.9. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

10.10. ГОСТ Р 54005-2010 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae».

10.11. ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям».

10.12. ГОСТ Р 54004-2010 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний».

10.13. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10.14. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

10.15. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

10.16. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу».

10.17. ГОСТ Р ИСО 707-2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб».

10.18. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

10.19. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

10.20. Стандарт ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006 «Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii».

10. 21. МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий — возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией».

10.22. Технический Регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».

(Измененная редакция. Изм. от 26.11.2013)

Приложение

Таблица для расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *